Le radiazioni UVB (ultraviolette B, lunghezza d’onda 280-320 nm) inducono la produzione di ROS, responsabili di danno cellulare, infiammazione intracorneale, alterazioni dell’idratazione corneale, assottigliamento dell’epitelio corneale e aumento dell’apoptosi. Da studi precedenti è emerso che il trealosio, un disaccaride del glucosio, ha ridotto lo stress ossidativo indotto dai raggi UVB attraverso la riduzione dello squilibrio antiossidante/proossidante nell’epitelio corneale irradiato, che porta alla riduzione della sovraespressione di citochine proinfiammatorie, metalloproteinasi della matrice e Hsp70 (heat shock protein 70). Inoltre, il trealosio ha ridotto l’apoptosi cellulare e ha soppresso l’infiammazione corneale e la neovascolarizzazione provocate dai raggi UVB. L’efficacia del trealosio sulle cellule epiteliali corneali è stato anche descritto da Aragona et al. e da Hill-Bator et al. Chen et al. hanno dimostrato l’effetto terapeutico del trealosio nella sindrome dell’occhio secco. Takeuchi et al. hanno dimostrato l’azione inibente del trealosio sul fattore di crescita dell’endotelio vascolare (vascular endothelial growth factor, VEGF) e sulla proliferazione dei miofibroblasti. Queste evidenze suggeriscono il potenziale utilizzo del trealosio come nuovo agente in grado di controllare l’angiogenesi e la fibrosi, e la sua utilità in chirurgia oculare. In questo studio è stata confrontata l’efficacia di due concentrazioni di trealosio (3% e 6%) nella riepitelizzazione delle lesioni corneali indotte da radiazioni UVB. I risultati hanno mostrato che entrambe le concentrazioni di trealosio utilizzate durante l’irradiazione con UVB hanno indotto a livello corneale una riduzione dello stress ossidativo attraverso la rimozione di eccessive quantità di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Dopo il trattamento con trealosio al 3% è stata osservata la riduzione dello stress ossidativo e del danno al DNA, mentre il trattamento con trealosio al 6% ha mostrato un effetto di prevenzione sullo stress ossidativo e sul danno al DNA. Le gocce di trealosio applicate per due settimane sulle cornee dopo irradiazione con UVB hanno consentito una completa riepitelizzazione delle lesioni ossidative corneali senza formazione di cicatrici non trasparenti. La concentrazione più elevata di trealosio è risultata più efficace.
In un primo esperimento, gli animali sono stati trattati durante i quattro giorni di irradiazione giornaliera con UVB con trealosio al 3% o 6% o con buffer (soluzione salina), tre gocce per ogni occhio per sei volte al giorno. Dopo le procedure di irradiazione (giorno 4 di irradiazione ripetuta), gli animali sono stati sacrificati e le cornee asportate sono state utilizzate per la misurazione dei ROS e per le analisi immunoistochimiche. Nel secondo esperimento, gli animali sono stati ripetutamente irradiati con raggi UVB per quattro giorni; tuttavia, il trattamento con trealosio al 3% o 6% o con soluzione salina è avvenuto successivamente alla procedura di irradiazione per una durata di quattordici giorni, tre gocce per ogni occhio, quattro volte al giorno (Figura 1). Al termine del trattamento, gli animali sono stati sacrificati e le cornee sono state esaminate microscopicamente e biochimicamente. Cornee normali di animali non trattati sono state utilizzate come controllo.
Figura 1. La schematizzazione grafica dei due esperimenti mostra le fasi di irradiazione UVB della cornea e di trattamento con buffer o con gocce di trealosio.
La colorazione fluorescente con diidroetidio (DHE), quale indicatore della produzione di ROS, è stata rilevata nelle cornee di controllo e nelle cornee irradiate trattate con gocce di trealosio (3% o 6%) o con gocce di soluzione salina. L’intensità della fluorescenza di DHE ha dimostrato che nelle cornee irradiate con UVB il trattamento con trealosio ha ridotto significativamente la produzione di ROS, rispetto alle cornee trattate con soluzione salina (Figura 2 A-B). Il trealosio al 6% ha ridotto la produzione di ROS più del trealosio al 3%.
Figura 2. Saggio colorimetrico DHE per misurare la produzione di ROS nelle cornee irradiate con UVB (una volta al giorno per 4 giorni) trattate con buffer o con trealosio al 3% o al 6%. L’intensità della fluorescenza è stata aggiustata attraverso la densità ottica integrale. (A) Rispetto alle cornee trattate con il buffer, lo stress ossidativo nell’epitelio corneale è stato ridotto dal 3% di trealosio e fortemente soppresso dal 6% di trealosio. (B) Nell’epitelio corneale trattato solo con buffer, l’intensità della fluorescenza era significativamente più elevata rispetto a quella dell’epitelio di controllo o dell’epitelio corneale trattato con trealosio al 3% o al 6%. *p<0,1; **p<0,01 rispetto alle cornee trattate con buffer.
Cornee irradiate con UVB riepitelizzano rapidamente (espressione di K3/K12) dopo il trattamento con trealosio al 3% e ancora di più dopo il trattamento con trealosio al 6%. L’espressione genica per IL-1b nelle cornee trattate con trealosio è risultata molto bassa (trealosio 3%) o quasi assente (trealosio 6%), mentre è risultata evidente nelle cornee trattate con soluzione salina (Figura 3).
Figura 3. Espressione genica di IL-1b nelle cornee irradiate con UVB di conigli trattati con trealosio (concentrazione del 3% o 6%) o con buffer per quattordici giorni dopo la fine dell’irradiazione ripetuta. (***p<0,001 rispetto alle cornee trattate con buffer).
Le immagini macroscopiche delle cornee, ripetutamente irradiate con raggi UVB per quattro giorni e trattate durante questo periodo con soluzione salina, mostrano una perdita della trasparenza e la cornea appare bianca e vascolarizzata. Dopo il trattamento con trealosio, la cornea è rimasta trasparente ed è stato osservato che la neovascolarizzazione è risultata significativamente soppressa con il trattamento con trealosio 3% e assente con il trattamento con trealosio 6% (Figura 4).
Figura 4. Nelle cornee del primo esperimento (cornee trattate durante l’irradiazione), la migliore efficacia curativa è stata ottenuta con il trattamento con trealosio al 6%, seguito dal trattamento con trealosio al 3%.
Nelle cornee irradiate per quattro giorni (una volta al giorno) e trattate con soluzione salina lo spessore corneale centrale è aumentato gradualmente. Il trattamento con trealosio durante l’irradiazione ha ridotto lo spessore corneale centrale. Tale effetto è stato molto più evidente nelle cornee trattate con concentrazioni più elevate di trealosio (Figura 5).
Figura 5. Variazione dello spessore corneale centrale in cornee irradiate con UVB durante i quattro giorni di trattamento. (*p<0,1; ***p<0,001) rispetto alle cornee trattate con buffer.
Dopo due settimane di trattamento delle cornee irradiate con UVB (una volta al giorno per quattro giorni), è stata osservata la riepitelizzazione delle cornee non-trasparenti con il completo recupero della trasparenza. Dopo il trattamento con trealosio al 3% la neovascolarizzazione corneale è stata marcatamente soppressa, mentre il trattamento con trealosio al 6% ha indotto la prevenzione della neovascolarizzazione corneale (Figura 6). Le gocce di trealosio hanno significativamente ridotto i livelli di spessore corneale.
Figura 6. Nelle cornee del secondo esperimento (cornee prima irradiate con UVB per 4 giorni e poi trattate con buffer o con trealosio per 14 giorni), la migliore efficacia curativa è stata ottenuta con il trattamento al 6% trealosio, seguito dal trattamento con trealosio al 3%.
L’irradiazione con UVB induce un’infiammazione corneale acuta, la fotocheratite, accompagnata dalla produzione di ROS, un aumento dello spessore corneale e una diminuzione degli antiossidanti. In questo studio è stata esaminata l’efficacia di trealosio a due concentrazioni (3% e 6%), in due esperimenti su cornee irradiate con raggi UVB. I risultati mostrano che entrambe le concentrazioni di trealosio posseggono potenti proprietà antiossidanti e antinfiammatorie. Il trealosio ha indotto la rimozione dell’eccessiva quantità di ROS nelle cornee irradiate. Il trealosio ad alta concentrazione è risultato più efficace. Sebbene il trattamento con trealosio a bassa concentrazione abbia indotto la soppressione dello stress ossidativo e il danno al DNA nelle cornee, il trattamento con trealosio a concentrazione più elevata ha mostrato un effetto preventivo nella manifestazione di questi processi. Lo stress ossidativo è coinvolto in una serie di malattie corneali umane e malattie infiammatorie della superficie oculare, tra cui la sindrome dell’occhio secco. Il trealosio ha mostrato efficaci proprietà antiossidanti. Infatti, come dimostrato in questo studio per la prima volta, il trealosio è in grado di ridurre l’eccessiva quantità di ROS nelle cornee irradiate. Il trattamento con trealosio, soprattutto a concentrazione elevata, ha consentito una rapida riepitelizzazione dell’epitelio corneale danneggiato o addirittura perso, in seguito all’irradiazione ripetuta con UVB. L’infiammazione intracorneale provocata dall’irradiazione con UVB, come mostrato dall’espressione dell’IL-1b, è stata significativamente ridotta dopo il trattamento con trealosio (concentrazione del 3%) ed è risultata assente dopo il trattamento con trealosio a concentrazione più elevata (6%). Le cornee sono guarite con il ripristino della trasparenza. Dopo il trattamento con trealosio è stata osservata una riduzione dello spessore corneale centrale (quale indice di idratazione corneale). Le variazioni dell’idratazione corneale sono importanti marker di guarigione e di trasparenza corneale. La neovascolarizzazione corneale è diminuita dopo il trattamento con trealosio al 3% ed è risultata quasi assente dopo il trattamento con trealosio al 6%.