I “batteri buoni”: probiotici e nuovi meccanismi immunologici

Riassunto

Il sistema immunitario associato alla mucosa intestinale svolge un ruolo fondamentale nel mantenere quei meccanismi definiti di tolleranza orale attraverso cui proteine e molecole potenzialmente dannose vengono riconosciute come non dannose per l’organismo. La flora intestinale contribuisce in modo determinante alla regolazione di tali processi protettivi. Al contrario nella patogenesi e nella regolazione della patologia allergica possono venir meno molti di questi meccanismi protettivi che coinvolgono sia l’immunità innata sia quella adattativa. La somministrazione di probiotici, “batteri buoni”, può contribuire a ripristinare il corretto processamento immunologico delle proteine allergeniche agendo sia nella prevenzione che nell’attenuazione dei sintomi della patologia immunoallergica.

 

Il sistema immunitario intestinale

La barriera intestinale costituisce una superficie di incontro molto estesa tra l’ospite e gli agenti esterni, tra i quali esistono molte sostanze che possono agire da antigeni, quindi in grado di attivare il sistema immunitario (SI) dell’ospite stesso. Il sistema immunitario del tratto gastrointestinale, definito GALT (Gut Associated Lymphoid Tissue), è l’organo immunitario più esteso ed ha il compito di impedire il contatto tra SI e antigene intatto (immunità innata), oppure di regolare le risposte agli antigeni che hanno superato la barriera (sistema immune adattativo). La risposta immunitaria può essere “buona”, quindi definita tolerogenica o “cattiva” e determinare un’infiammazione, un’infezione o una risposta iperergica come nel caso della reazione allergica.

Normalmente le proteine della dieta sono fisiologicamente sottoposte a degradazione e distruzione dei loro epitopi conformazionali per l’azione del processo digestivo, determinando uno stato di “ignoranza immunologica” e solo circa il 2% di queste rimangono immunogenicamente intatte. Il destino “immunologico” di tali proteine può seguire tre vie:

a) un gruppo di cellule chiamate, “cellule M”, sparse tra gli enterociti della barriera intestinale, campionano l’antigene nella mucosa intestinale e lo trasportano per endocitosi alle cellule dendritiche (DC) situate nelle “Placche del Peyer”;

b) l’antigene viene campionato direttamente nel lume intestinale attraverso le “braccia”, ovvero i dendriti, delle DC localizzate nella lamina propria;

c) l’antigene passa direttamente dal lume alla lamina propria attraverso giunzioni tra le cellule epiteliali (tight junction) che si sono allentate per qualche insulto esogeno concomitante (1,2).

Quale che sia la via che ha permesso all’antigene di attraversare la barriera intestinale, questo viene immunologicamente processato nelle molecole di istocompatibilità di classe II (MHC-II) da parte delle DC. Le DC sono una popolazione cellulare del sistema “innato” specializzata nel presentare l’antigene (APC). Esse da un lato esprimono tutti i recettori del sistema immune innato, dall’altro hanno il potenziale di catturare l’antigene, processarlo in piccoli peptidi e presentarli in una tasca delle molecole di superficie MHC che vengono riconosciute dai linfociti T helper CD4+ situati o direttamente nelle stesse placche del Peyer della mucosa intestinale o nei linfonodi locoregionali mesenterici. È a questo punto che si attiva il sistema di difesa del SI per rendere inerti gli antigeni processati, attraverso meccanismo di risposta umorale, quale la sintesi di immunoglobuline di diverse classi (IgA, IgM), oppure cellulari, attraverso linfociti T con memoria immunologica verso l’antigene, localizzati a livello intraepiteliale (IELs) oppure nella lamina propria ed in grado di attivare altri “bracci effettori ” o “regolatori” della risposta immunitaria.

 

Meccanismi di tolleranza orale

La “tolleranza orale” è definita come la soppressione specifica delle risposte immuni cellulari o umorali ad un antigene per mezzo della precedente somministrazione dell’antigene stesso attraverso la via orale. Essa è, quindi, la risposta usuale sia a proteine della dieta, che sono rimaste “immunogeniche”, sia ai batteri commensali (microbiota intestinale) ed un fallimento nell’instaurarsi di tali meccanismi può comportare, per esempio, lo sviluppo di meccanismi di ipersensibilità ad alimenti o un’infezione. I meccanismi coinvolti nel mantenimento della tolleranza orale sono i seguenti:

a) degradazione delle proteine per opera dell’acidità gastrica e degli enzimi intestinali;

b) integrità della barriera epiteliale: alcuni stimoli quali alcool, infiammazione dell’epitelio stesso o immaturità facilitano il by pass degli antigeni attraverso tight junction allentate;

c) immunocomplessi IgA-antigene attraversano l’epitelio e sono presentati alle DC nelle Placche del Peyer ove regolano l’espressione di alcune molecole necessarie al costimolo dei linfociti T helper e quindi alla loro attivazione;

d) modulazione della presentazione antigenica: una volta che l’antigene è stato captato dalle DC, se presentato in “alte dosi” determina anergia o delezione clonale (apoptosi) dei linfociti T reattivi; se presentato in “basse dosi” favorisce l’attività delle cellule T regolatorie (Treg) che sopprimono la risposta immune delle cellule T effettrici attraverso il rilascio di citochine solubili quali IL10 e TGF-beta (3);

e) stimolazione ed attivazione delle DC da parte di stimoli dell’immunità innata attraverso dei recettori denominati PRRs (Pattern Recognition Receptors). Questi recettori sono presenti direttamente sugli enterociti, sui macrofagi della lamina propria o direttamente sulle DC stesse e riconoscono strutture microbiche “conservate” dette PAMPs (Pathogen Associated Molecular Pattern), per esempio sulla superficie dei batteri che costituiscono la flora intestinale.

 

Ruolo del microbiota intestinale

Il corpo umano ospita, nei propri organi ed apparati comunità di microrganismi utili pari a circa 500 specie di batteri che superano le cellule del corpo umano di un rapporto di 10:1 per una massa totale di circa 1 Kg.

Tale popolazione di microrganismi, che è definita “microbiota”, varia, sia nelle specie che nella densità, a partire dallo stomaco, fino al retto e svolge processi fisiologici “in cambio” di nutrienti ed un habitat in cui riprodursi (4).

L’esposizione microbica all’inizio della vita comincia con la colonizzazione dell’intestino del neonato che può avvenire o attraverso i batteri del canale vaginale e fecali dalla madre o da batteri esterni nel caso di parto cesareo. La dieta è un altro importante fattore che contribuisce allo sviluppo del nucleo microbiotico all’inizio della vita: il latte ed il colostro sono da un lato una continua sorgente di batteri commensali, dall’altro fonte di oligosaccaridi che vengono fermentati dalla flora del lattante. La microflora intestinale del neonato è in generale costituita da Bifidobatteri, così come durante il periodo della lattazione, mentre durante lo svezzamento verranno a predominare Lactobacilli e Clostridi (5).

La flora batterica gastrointestinale costituisce un sistema fondamentale di controllo sull’omeostasi del sistema immunitario (SI) sia a livello locale (mucosale) che sistemico. Gli organismi commensali dell’organismo svolgono un ruolo fondamentale sia nello sviluppo degli organi linfoidi come il GALT (6), sia nel controllo di quei meccanismi di tolleranza orale sopra descritti. La destabilizzazione della normale microflora può determinare, di conseguenza, alterazioni del sistema immunitario, suscettibilità a diverse infezioni e patologie croniche.

 

I probiotici 

I probiotici sono microrganismi vivi che, quando somministrati in quantità adeguata, alterano la microflora dell’ospite e conferiscono un beneficio in termini di salute. Uno di questi benefici avviene per opera dei prodotti della fermentazione anaerobica i cui substrati sono fibre della dieta non digeribili e carboidrati. Si definiscono quindi prebiotici componenti dei cibi, fermentabili e non digeribili, che stimolano selettivamente la crescita e l’attività di determinati ceppi batterici nel colon e determinano un beneficio in termini di salute. I simbiotici sono una combinazione di probiotici e prebiotici tale da determinare una maggiore efficienza in termini di benefici sulla salute di quelli ottenuti dai due componenti isolati (7).

Ci si aspetta quindi che i probiotici possano da un lato partecipare ai processi di ricostituzione della flora intestinale distorta per diverse cause, dall’altro prevenire o contenere in parte certe patologie per mezzo dei loro effetti modulanti sul SI. I probiotici esercitano multiple e diverse influenze sull’ospite, sia influenzando l’ambiente del lume intestinale (modificazione del microbiota intestinale) e le funzioni della barriera epiteliale, sia agendo su fini meccanismi del SI mucosa associato (8):

a) MODIFICAZIONE DEL MICROBIOTA INTESTINALE
I probiotici possono produrre sostanze dette bacteriocine o modulare la produzione di defensine da parte delle cellule epiteliali, alcune delle quali inibiscono altri batteri commensali oppure patogeni.
Un altro meccanismo antimicrobico è l’inibizione dell’aderenza dei batteri patogeni, che può avvenire sia attraverso la competizione per i siti di attacco mannoso specifici sulla cellula epiteliale, sia attraverso l’inibizione della traslocazione batterica, per esempio riducendo l’abilità di E. coli patogeni di iniettare fattori di virulenza nelle cellule o di interrompere così le tight junction intracellulari. Infine i probiotici competono per i nutrienti con i batteri patogeni e riducono il pH intestinale producendo un ambiente fisiologicamente restrittivo per la loro crescita.

b) RAFFORZAMENTO DELLA FUNZIONE DI BARRIERA
I probiotici possono rinforzare l’integrità della mucosa intestinale rendendola meno vulnerabile all’invasione dei patogeni; essi possono alterare la produzione di muco da parte delle cellule caliciformi: per esempio il Lactobacillus plantarum e il Lactobacillus rhamnosus (LGG) sono in grado di aumentare la produzione di mucine che impediscono l’aderenza di un ceppo enteropatogeno di E. coli (9). Un altro meccanismo di rafforzamento consiste nell’influenzare le interazioni cellulacellula e la stabilità della barriera intestinale attraverso la modulazione del citoscheletro e la fosforilazione di proteine che costituiscono le tight junction mediante segnali che partono dall’interazione dei peptidoglicani della parete cellulare con recettori sulle cellule epiteliali (10). Il Lactobacillus rhamnosus (LGG) è inoltre in grado di aumentare l’espressione di alcune “Heat Shock Protein” (HSP) nelle cellule epiteliali conferendo loro una ulteriore protezione verso segnali di apoptosi (morte cellulare) (11). Infine i probiotici rafforzano la neutralizzazione dei patogeni da parte delle IgA secrete nel lume intestinale. Alcuni ceppi come il Lactobacillus rhamnosus (LGG) e il Bifidobacterium lactis Bb-12 aumentano la produzione di IgA resistenti alle proteasi e capaci di intrappolare i patogeni nel muco per poi essere trasportate attraverso la superficie basolaterale delle cellule intestinali (transocitosi) mediante recettori polimerici per le immunoglobuline (12).

c) IMMUNOMODULAZIONE 

Effetto dei probiotici sulle cellule epiteliali
I batteri commensali agiscono sulle cellule epiteliali attraverso il riconoscimento di strutture batteriche da parte di PRRs (Pattern Recognition Receptors) tra cui i cosiddetti Toll-like receptors (TLR). Tale interazione induce direttamente la produzione di citochine protettive che aumentano la rigenerazione delle cellule epiteliali e ne inibiscono l’apoptosi durante la guarigione da un danno, come nel caso del Lactobacillus rhamnosus (LGG) in grado di attivare, per mezzo di TNF-α, IL-1α o INF-γ, protein kinasi antiapoptotiche e inibire protein kinasi proapoptotiche in cellule del colon umane o di topo (13). L’interazione tra i batteri commensali e i TLR è effettivamente necessaria per mantenere l’integrità architetturale della superficie intestinale. Ciò è stato dimostrato da esperimenti in cui avveniva una risposta esagerata al danno della mucosa intestinale non solo in topi con un deficit delle molecole di trasmissione del segnale via TLR, ma anche animali da esperimento deprivati della microflora intestinale. Tale danno avveniva non per la crescita esagerata dei batteri commensali ma per la perdita dell’integrità della barriera. La reintroduzione dei batteri commensali a tali animali preveniva il danno (14). La distribuzione sulla cellula epiteliale dei TLR è cruciale nelle risposte ai batteri. Per esempio TLR2 e TLR4 sono espressi a livelli bassi sulla superficie apicale delle cellule epiteliali determinando una risposta di “tolleranza” ai peptidoglicani e all’LPS dei batteri commensali. Al contrario il TLR5 interagisce sulla superficie basolaterale degli enterociti con la flagellina dei batteri patogeni determinando una risposta pro-infiammatoria; tale interazione è impedita per certi tipi di E. coli commensali. Infine l’interazione tra le strutture batteriche, quali per esempio LPS dei batteri Gram negativi e i TLR può essere modulata dall’attività di enzimi, quali la fosfatasi alcalina intestinale che defosforila l’LPS rendendolo incapace di attivare il TLR4 (15).

Inoltre, se da un lato i batteri patogeni inducono delle risposte proinfiammatorie verso le cellule epiteliali attraverso l’attivazione di segnali del fattore di trascrizione NFKB, le specie non patogene sono in grado di attenuare tali risposte bloccando la degradazione di fattori controregolatori, come IkB (16). Sebbene gli enterociti possano agire come APC, è stato dimostrato come esse non riescano ad esprimere le molecole di costimolazione in presenza dei batteri commensali e quindi indurre uno stato di anergia ai linfociti T CD4+. In risposta ai batteri commensali le cellule epiteliali producono anche molecole quali TGF-α e TSLP che sopprimono l’attivazione immune delle DC (vedi sotto) e promuovono un ambiente non infiammatorio.

Effetti dei probiotici sulle cellule dendritiche
Le DC presenti nell’epitelio intestinale o nella lamina propria riconoscono attraverso i PRRs quelle strutture, denominate PAMPs presenti sui batteri probiotici. I probiotici possono modulare il sistema immune mucosale verso una risposta non infiammatoria e tolerogenica attraverso l’induzione di cellule T con proprietà regolatorie. I linfociti T CD4+ con attività regolatoria (Treg) svolgono un ruolo chiave nel sopprimere l’attività infiammatoria e la differenziazione di cellule effettrici ad attività helper (TH) o citotos sica (TC). Diversi modelli murini hanno dimostato gli effetti dei probiotici sulla risposta T regolatoria. I topi knock out per i geni che codificano per IL-10, la citochina cardine della risposta Treg, sviluppano spontaneamente una colite ulcerosa in associazione ad uno sbilanciamento tra Lactobacilli protettivi e batteri aerobi patogeni a favore di questi ultimi. Tale effetto viene controbattuto dalla inoculazione per via orale di Lactobacillus reuteri (17,18). I probiotici inducono una risposta T regolatoria attraverso la maturazione delle DC. Lactobacillus casei e Lactobacillus reuteri, per esempio, inducono la produzione di IL-10 da parte di linfociti T CD4+ o attraverso l’interazione con i TLR9 (19) o per interazione diretta sulle DC con la lectina di tipo C (DC-SIGN). Questo meccanismo sembra essere implicato nei meccanismi benefici dei probiotici nella dermatite atopica (20). I probiotici possono anche sopprimere le risposte TH1 e inibire la produzione di citochine infiammatorie quali IL-12, TNF-α e INF-γ da parte delle stesse DC, così da favorire una risposta antinfiammatoria. Il profilo citochinico che predomina dipende dalla natura dello stimolo e dal tipo di probiotico. Certi ceppi di Lactobacilli agiscono direttamente sulle cellule epiteliali intestinali che rispondono attraverso il rilascio di TGF-α e Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP), che a loro volta promuovono la differenziazione di DC immature in DC regolatorie (21). Uno schema semplificato dell’azione dei probiotici è rappresentato in figura 1.

 

Probiotici e immunopatologia della risposta allergica

La rottura del meccanismo di tolleranza orale è alla base delle risposte immuni da ipersensibilità, come la risposta allergica. In un soggetto geneticamente predisposto, l’allergene, dopo aver superato la barriera mucosa, viene fagocitato da cellule specializzate dell’immunità innata (DC e macrofagi) e “presentato” ai linfociti dell’immunità acquisita. Questa interazione tra cellule dell’immunità innata e acquisita è alla base dei segnali molecolari successivi che indurranno i linfociti verso un fenotipo TH2 piuttosto che TH1, a produrre gli anticorpi IgE (fase di sensibilizzazione) ed infine, riconoscere il proprio recettore sulle cellule bersaglio (fase effettrice).

Studi in vitro dimostrano come i probiotici determinino uno shift da una risposta TH2 ad una risposta TH1 mediata. L. rhamnosus (LGG) è in grado di inibire la produzione di citochine TH2 da parte di PBMC di pazienti allergici attraverso l’induzione di IL-12, mentre certi Bifidobatteri inibiscono le citochine TH2 mediante la produzione di IL-10 da parte di monociti (22). Esistono a tal proposito sia modelli sperimentali su animali che umani: la supplementazione di alcuni probiotici a topi da esperimento adulti con asma migliora alcune caratteristiche come l’eosinofilia nelle vie aeree, la risposta citochinica locale e l’iperresponsività bronchiale (23).

Il Lactobacillus paracasei ST11, per esempio, riduce i sintomi e i markers della risposta allergica quali la produzione di IL-5 e l’infiltrato eosinofilo nella mucosa nasale ed aumenta la sintesi di TNF-α, IFN-γ, IL-10 e IL-12 in soggetti con rinite allergica da betulla e acari (24-25). Uno studio britannico ha dimostrato come il Lactobacillus casei shirota, somministrato per 5 mesi nel latte, riduceva in modo significativo i livelli di IL5, IL6 e INF-γ dipendenti dall’antigene in soggetti con rinite allergica da graminacee (26). L’azione delle DC, determinante nel direzionare l’attivazione delle cellule T in risposta all’allergene, verso un fenotipo TH2 piuttosto che TH1, può quindi essere modulata dall’azione “adiuvante” dei probiotici. Alcuni probiotici, come il Lactobacillus casei, modulano direttamente alcuni segnali intracellulari nelle DC che bloccano la produzione di IgE (27). La supplementazione con la dieta di L. rhamnosus (LGG) e Bifidobacterium lactis Bb-12 poteva indurre la proliferazione di Treg producenti TGF-β e ciò correlava con la soppressione di sintomi allergici in un modello murino di asma (28). Anche in un modello di dermatite allergica da contatto, per esempio, la somministrazione orale di Lactobacillus casei riduceva l’infiammazione cutanea attraverso l’espansione di CD4+ secernenti IL-10 (29). Il Lactobacillus casei e il Bifidobacterium longum inibiscono la produzione di IgE in modelli murini. Tale effetto può essere dovuto alla capacità di alcuni specifici ceppi batterici di inibire la sintesi di IL-4 (30).

Anche la fase “effettrice” della risposta allergica può essere modulata dai probiotici: il Lactobacillus reuteri inibisce per esempio la funzione effettrice dei mastociti ed il rilascio di istamina, il Bifidobacterium longum sopprime invece l’espressione di recettori per l’istamina, mentre altri ceppi agiscono a monte sulle citochine che reclutano gli eosinofili quale la IL-5 (31).

Il fatto che l’utilizzo dei probiotici possa avere un effetto sinergico con l’effetto immunomodulatorio nella Immunoterapia Specifica (ITS) è suggerito dal fatto che la combinazione di lactobacilli acidofili e allergene era in grado di sopprimere le risposte IgE mediate in modelli murini di pollinosi al cedro (32).

È infine supposto che la disregolazione della flora intestinale potrebbe anche precedere lo sviluppo della patologia allergica. Non solo esistono delle differenze nella composizione del microbiota tra bambini che sviluppano precocemente sintomi di atopia e bambini sani, con una prevalenza di Clostridi e Bacterioidi e una riduzione in Lattobacilli e Bifidobatteri, ma l’utilizzo di alcuni ceppi, come il Lactobacillus rhamnosus in una finestra temporale della prima infanzia, potrebbe contribuire a prevenire lo sviluppo della dermatite atopica (33).

I meccanismi qui descritti rappresentano il presupposto per l’efficacia clinica dei probiotici sulle patologie allergiche, sia nel controllarne i sintomi e le complicanze sia nella prevenzione delle stesse. È tuttavia necessario aumentare la nostra conoscenza della composizione e le funzioni del microbiota intestinale, identificarne le differenze tra i soggetti e applicare tali conoscenze a studi clinici rigorosi che tengano conto degli effetti specifici suggeriti da ogni ceppo di probiotico e di tutti i fattori fisiologici e patologici che ne possono influenzare la somministrazione e l’azione.